一、材料及方法

（1）卵泡采集和组织切片。

从有规则产蛋周期的三黄母鸡中取出等级前卵泡，按直径分为小白卵泡（SWF，1～3mm），大白卵泡（LWF，3～5mm），小黄卵泡（SYF，5～6mm）和大黄卵泡（LYF，6～9mm）。各级卵泡用4%多聚甲醛固定244%h，然后切片，片厚5μm。经HE染色后，观察显微镜下的组织结构，并用显微数字成像系统将图像传输到计算机上。使用显微数字成像系统。SimplePCI高级图像分析软件测量卵泡颗粒层和膜层的厚度，以及颗粒细胞的密度。

（2）卵泡培养和激素处理

取出等级前卵泡后，用生理盐水冲洗，以1个卵泡/孔的密度接种在24个孔培养板上。根据卵泡直径，发育阶段相似的卵泡随机分为两组，即对照组和FSH处理组。培养液含0.5％胎牛血清（FCS）的M199培养液（Hyclone）。预培养16h之后，取出血清，换成10μg/mL胰岛素，5μg/mL转铁蛋白和3×10-8mol/L亚硒酸钠的ITS培养液。还添加了11种培养液。.75mmol/LHepes，2mmol/L谷氨酰胺，100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素℃，5％CO继续在2的培养箱中进行培养。同时培养10个。ng/mLFSH处理48h。每个处理组4验重复3次。

(3)5-溴-2-脱氧尿嘧啶

卵泡悬浮培养48h最终浓度为15μg/mL的BrdU，继续培养4h，然后用4%以上的聚甲醛固定，切片。切片用3%。H2O2温育30min灭活内源性过氧化物酶，室温下用山羊血清封闭20min加入甲酰胺100℃变性核酸5min，冰水浴冷却后，加入小鼠抗性BrdU抗体，4℃过夜后滴加羊抗鼠IgG二抗，37℃孵育20min，用DAB室温显色，阳性细胞呈棕红色，计算出阳性细胞的百分比。

(4)数据分析

采用所得数据SAS软件中GLM方差分析和过程Duncan检验误差为5%和1%。

二、实验结果

（1）卵泡膜层和颗粒层的形态变化

前卵泡组织学研究结果表明，SWF只有一层颗粒细胞，LWF两层颗粒细胞出现在中间，而两层颗粒细胞出现在中间SYF和LYF中间有多层颗粒细胞。基膜外的结缔组织分化形成卵泡膜层，其中膜细胞随着卵泡水平的增加而变成多层，分化为内膜细胞层和外膜细胞层。同时，统计显示，随着卵泡直径的增加，卵泡膜层和颗粒层的厚度显著增加，颗粒细胞的密度也呈现出类似的变化趋势

(二)等级前卵泡颗粒细胞BrdU标记指数的变化

等级前卵泡BrdU结果表明，随着卵泡直径的增加，颗粒细胞BrdU标记指数显著增加，即随着等级前卵泡的发育，颗粒细胞的增殖活性增强。

（三）FSH对卵泡细胞增殖的影响

10级前卵泡ng/mLFSH处理48h，随后的组织学研究和数据统计分析结果表明，与对照组相比，FSH处理组LYF中颗粒层厚度增厚19.7%。随之而来。FSH增加处理剂量，SYF和LYF中颗粒细胞密度分别增加25.7%和30.3%。但在体外卵泡培养过程中，FSH卵泡膜层的厚度在处理后没有显著变化。

三，结论

卵泡是卵巢中生长最快的正常组织之一，与卵母细胞一起形成卵泡的体细胞的发育是其生长的主要原因。本实验对产卵母鸡等级前卵泡的组织切片显示了小卵泡中卵泡细胞的发育过程。SWF只有一层立方形颗粒细胞与卵母细胞形成初级卵泡；LWF，SYF和LYF中颗粒细胞增加到2~3层，颗粒细胞数量显著增加，从而形成次级卵泡。该实验还表明，随着卵泡体积的增加，膜细胞增殖为多层，分化为功能完全不同的内膜细胞和外膜细胞层。上述结果表明，卵泡细胞的生长变化是卵泡发育的重要标志。FSH在维持和调节卵泡发育中起着重要作用。FSH能促进卵巢颗粒细胞的增殖。用碘化FSH自显摄研究证实，FSH颗粒细胞首先出现在颗粒细胞中，可见卵巢主要是颗粒细胞表达FSH受体。FSH促进鸡颗粒细胞的增殖。最近的研究报告，FSH通过Akt提高细胞周期蛋白D2的表达和抑制AMPK最终刺激颗粒细胞增殖的活性。本实验采用体外卵泡悬浮培养，研究FSH对卵泡细胞增殖的影响。结果表明，10ng/mLFSH显着增加SYF和LYF中颗粒层厚度和颗粒细胞密度，但FSH对卵泡膜细胞没有显著的促增殖作用。由此可见，FSH小卵泡的发育具有阶段性和细胞类型特异性，即FSH显著促进即将到来的卵泡中颗粒细胞的增殖，从而加速卵泡的发育。简而言之，本实验通过体内外研究显示了前卵泡中膜细胞和颗粒细胞的形态变化，并证明了FSH能显着刺激SYF和LYF中颗粒细胞的增殖促进等级前卵泡的发育。