【摘要】急性肺损伤(acutelunginjury,ALI)/急性呼吸窘迫综合征(acuterespiratorydistresssyndrome,ARDS)是由于弥漫性肺泡-毛细血管膜损伤导致的以非心源性肺水肿和炎症为病理特征的急性呼吸衰竭,ARDS是ALI的严重阶段｡不同肺损伤的实验动物模型已经被用来研究肺损伤的机制｡这些动物模型大多数根据已知的ALI的危险因子复制的,例如脓毒血症､继发于骨折的脂肪栓塞､吸入酸性物质､肺或末端血管床的缺血-再灌注以及其他的临床危险因素,但所有这些模型都不可能完全充分复制人类肺损伤的特征｡文中旨在概括现有动物模型的优､缺点,讨论目前ALI的几种主要模型,为研究者们在ALI的动物研究的设计提供帮助｡
【关键词】急性肺损伤;急性呼吸窘迫综合征;动物模型
0 引言
ALI及其严重阶段ARDS是由各种肺内外因素引起的急性､进行性缺氧性呼吸衰竭,属于危重症,发病率高,致死率也极高,虽然近几年关于其发病机制及其治疗方法的研究取得了很大的进步,但是诱发和促使肺损伤进展的基本机制尚未完全阐明｡与ALI相关医学研究的进步依赖于相应的基础生物医学的不断发展,与ALI相关动物模型的研究也是必不可少的｡
1 人类肺损伤的病理生理特点及动物模型所面临的挑战
1.1 人类肺损伤的病理生理特点
ALI早期主要表现为急性炎性反应伴有肺实质的水肿､出血和透明膜的形成,在气管插管和机械通气的患者中,急性炎性反应期后是慢性纤维增生期,主要表现为肺泡膜和肺泡腔内成纤维细胞及Ⅰ型和Ⅲ型纤维细胞的增生｡
ALI的主要病理变化是肺泡-毛细血管膜的急性弥漫性损伤｡由于肺泡毛细血管内皮细胞和肺泡上皮细胞的通透性增加,以及肺泡上皮细胞及时清除肺泡内液体的能力下降,从而引起肺泡及间质渗透性水肿｡肺泡及间质水肿可引起肺内分流增加导致严重的通气血流比例失调｡肺泡液的清除能力下降是肺水肿的形成的关键步骤,有研究表明,与男性相比女性对水肿液的清除能力更迅速[1]｡中性粒细胞的聚集是促进ALI/ARDS发生发展的关键步骤,由此引起的一系列促炎和抗炎反应会造成肺组织的损伤[2]｡当ALI/ARDS被第1次描述时,表面活性剂的失调就被首先考虑了｡Ⅱ型肺泡上皮细胞所分泌的表面活性剂的组成和功能也已被许多研究所证实,ALI/ARDS时上皮细胞的损害比对内皮细胞的损害更为严重,微血栓的形成也被血管造影等技术所证实[2]｡
1.2 动物模型所面临的挑战
在ALI/ARDS发生和发展的过程中活体肺部病理变化的研究受到了限制,大部分信息是从尸检肺及肺组织活检中得到｡要想了解肺损伤阶段性的实况及全景动物模型的研究就发挥了重要作用｡理想的ALI的动物模型应能够复制人类肺损伤发生的病理生理过程,但是目前现有的动物模型只与人类肺损伤的某些方面有相似性,没有一种模型可以复制出人类ALI/ARDS的所有特点｡①大部分模型的制备只是基于1种或最多2种方法来诱导造成肺损伤的,然而人类的ALI/ARDS却很少由单一因素引起,并且人类的ARDS是原始危险因素､并发症､先天性因素之间复杂的相互作用结果｡②动物模型在先天免疫及不同种族之间的差异,可能会影响实验结果对人类肺损伤的准确对应解释｡③大部分模型针对的是一个最主要的组织,肺泡上皮､肺泡毛细血管内皮或是两者兼有,但在人类ALI/ARDS的最主要肺组织上面的靶点部位还不明确｡因此,动物模型的这些局限性单独地或联合起来可能会导致与人类肺损伤不同的甚至矛盾的实验结果,造成在动物身上有效的干预方法却不能在人类身上取得疗效｡然而,如果动物模型能被很好的做出对应人类ALI的解释,实验结果能在有限范围内被很好的阐述,这样的动物模型可为人类肺损伤反应的关键步骤提供重要的实验依据｡
2 肺损伤动物模型的特点
不同动物模型的研究为ALI的研究提供了大量的科研信息,虽然许多不同动物种类已被用来研究肺损伤,然而对损伤的反应动物种类之间有很重要的区别｡大部分的ALI的动物模型是建立在哺乳动物身上的,其中啮齿类的小鼠或大鼠是最广泛应用的｡
2.1 啮齿类模型
小鼠或大鼠体型小,生长繁殖迅速,来源容易,是ALI实验研究中的一种实用有效的重要工具,除此之外,对基因修饰小鼠的研究发展迅速,应用广泛,而且基因修饰的小鼠已被广泛应用于肺炎性反应的研究,充分利用小鼠的基因优势,研究者们能够更好的从分子水平上理解和掌握疾病的发生和发展过程｡主要表现的与人类的重要区别点:①先天性免疫方面,首先人类和一些低等动物的白细胞和一些间质细胞识别微生物的产物是凭借一群特异的识别受体称为Toll样受体(tolllikereceptors,TLRs),人类和小鼠的一些TLRs细胞表达和结构是不同的[3],因此它们可识别的脂多糖结构也存在差异｡其次在单核吞噬系统方面,在正常人类肺中存在肺血管内巨噬细胞(pulmonaryintravascalarmacrophages,PIM),它是黏附在肺毛细血管内皮细胞上的成熟巨噬细胞中的一种常驻细胞,而小鼠中缺乏PIM,血管内的巨噬细胞主要局限在肝和脾中,在具有PIM的种族中,例如人类､羊､猪等血液中的悬浮微粒､细菌脂多糖可被局限在肺;而在缺乏PIM的种族中,例如小鼠､大鼠､犬和兔等血液中的悬浮微粒物质主要局限在肝和脾｡因此,小鼠与人类的肺内防御免疫屏障存在差异｡②NO方面,临床研究和动物模型表明NO参与肺损伤的发病机制[4],首先可诱导的NO激(induciblenitricoxidesynthase,iNOS)的作用与活性NO的含量在小鼠和人类是不一样的,啮齿类动物如鼠类的肺泡巨噬细胞能产生大量的NO,然而正常非激活的人类巨噬细胞产生的NO却微乎极微｡③中性粒细胞趋化因子和趋化因子受体方面,CXC趋化因子白细胞介素-8(IL-8)的功能主要是招募中性粒细胞到特定部位参与炎性反应,大鼠和小鼠由于缺乏相应的基因不能表达CXCL-8,但可产生2种CXC相关的趋化因子,即肝巨噬细胞和巨噬细胞炎性反应蛋白2(macrophageinflammatoryprotein2,MIP-2),它们被认为与人类CXCL-8在功能上是相同的,因为它们在招募中性粒细胞至肺组织中具有关键性的作用[5]｡④其他,肺损伤动物模型大小对一些生理参数,如动脉血氧分压和平均动脉压等监控是尤其重要的｡如小鼠体型小在一定程度上限制了生理参数的测量｡小的可植入的无线电遥测信号传递器的发展使小鼠血压､心率和体温的测量成为了可能｡还有研究表明,调控炎性反应的基质蛋白表达在小鼠和人类身上也是不一样的[6]｡由于在鼠类体内自然杀伤细胞的活性是高于人类的,肺损伤应激反应可引起小鼠体内自然杀伤细胞的潜在不稳定性[7]｡
2.2 兔､犬､猪､羊模型
属于大型哺乳动物,常常被用来研究ALI的的生理调控机制以及支持治疗等,这些动物从进化角度上与人类之间也更亲近,一般能够满足一定的采血量｡兔性格温顺易于操作;猪和绵羊的肺部生理情况与人类相似,价格较灵长类动物低廉,便于应用支持措施和观察病理生理变化;犬属于大型动物,对手术的耐受性好,机械通气方面采用的较多｡猪､羊､犬适用于反复的肺泡灌洗模型､油酸模型以及内毒素模型的制造,绵羊常用于制造烟吸入型及烧伤型的动物肺损伤模型[8]｡有研究表明,犬和兔与人类在肺防御免疫系统方面有区别,因为犬和兔体内缺乏PIM,而这些巨噬细胞可降低内毒素介导的肺损伤反应｡
2.3 灵长类模型
灵长类动物进化程度高,与人类亲缘关系最近,是目前实验研究中与人类最为相似的理想动物｡但价格高,繁殖周期长,动物保护等原因未能广泛应用于实验研究｡
3 诱导ALI模型常见的几种动物模型
多数ALI模型是基于临床ALI/ARDS的致病因素设计而成的,如感染､误吸､创伤､药物和化学品､组织缺血-再灌注损伤等｡依据这些危险因素,科研者们相继复制出了不同的动物模型,来研究这些肺损伤的发病机制和治疗策略等｡如研究越来越多的输血相关的ALI动物模型,这些模型通常建立于大鼠或兔的灌注肺上[9],Nicholson等[10]成功制造了由创伤引起的输血相关大鼠肺损伤模型｡虽然临床上高浓度的氧诱发的肺损伤并不多见,但有关高氧肺损伤动物模型的报道也很多,尤其是对某些因子的研究,Husari等[11]从高氧肺损伤大鼠模型中发现,
活化蛋白C(activatedproteinC,APC)通过抗血栓形成和抗炎机制可减轻肺损伤反应｡各种中毒所致的肺损伤近几年来也不断成为研究的热点和难点,莫晨等[12]成功模拟了稳定､重复性好的敌敌畏中毒的大鼠模型｡由于百草枯的难治性､致死率高等特点,百草枯中毒引起的肺损伤的大鼠模型也不断完善,支巧明等[13]通过一次性腹腔注射18mg/kg的百草枯溶液制造出了大鼠肺典型的纤维化过程｡其他还有酸误吸型､创伤性､缺血-再灌注损伤等肺损伤动物模型的研究也都取得了进展,下面主要介绍3种最广泛被应用于科研的模型｡
3.1 肺泡灌洗型
ALI常伴随肺泡表面活性物质(pulmonarysurfactant,PS)减少,PS减少引起肺损伤发生机制主要为肺泡萎陷､肺不张､肺水肿,造成严重的肺内分流,并使肺的顺应性下降｡用等渗盐水反复灌注肺同样可引起PS减少｡该模型主要用于PS替代治疗以及肺表面活性物质缺乏的ALI中的研究,PS在维持肺泡功能方面起重要作用,PS主要由Ⅱ型肺泡上皮细胞分泌产生,它一直被认为是在肺泡清除液体中起关键的作用[14]｡
不同研究中利用肺泡灌洗(bronchoalveolarlavage,BAL)来诱发肺损伤反应的动物或方法有很大的差异｡成年猪､犬和羊经常被用来制造此种模型,对这些动物而言雌雄均可,重量均控制在20-40kg[15],为了研究更广泛,年幼的甚至刚出生的动物[16]和年老的动物[17-18]都要被研究｡灌洗液经常使用37-39℃的等渗盐水,有时候会加用低浓度的清洁剂,进一步使肺泡的表面活性剂失活,操作时一般使动物呈仰卧位,但为了在整个肺中能获得统一均匀的肺损伤水平,也有一些研究者们把动物从仰卧位变换为俯卧位或两肺轮流灌洗｡在个别案例中,为了能够在个体中达到参考对照,肺损伤只在单侧肺中被诱导｡有研究者们复制出了海水型的肺损伤动物模型,用于研究海水溺水者的救治,更适用于ALI后肺表面活性物质的改变及肺比阿米那活性物质替代治疗的研究[19]｡
3.2 油酸模型
油酸模型常用来复制临床中脂质栓塞引起的肺损伤,尤其是临床中常见的长骨干骨折引起的脂肪栓塞,油酸引起的ALI是目前制备动物ALI较为成功的模型,与临床ARDS患者最为类似,因此成为目前国内外公认的ARDS动物模型｡油酸直接损伤肺泡毛细血管内皮细胞膜可能是最主要发生机制,其次还可进而通过氧化应激反应､促凝血活性增高以及内皮素等促进肺损伤反应｡有研究者认为,油酸既可通过增加内皮细胞的通透性,也可阻断钠通道从而促进肺泡内和肺泡间隙液体的积聚,这2种因素都对ARDS的发生起促进作用[20]｡在动物模型中,油酸模型可分别通过股静脉导管或肺动脉导管注入油酸至中心静脉或右心房而诱导,大鼠或小鼠通常通过腹腔静脉注入,也有的实验是通过颈内静脉,家兔通常为耳缘静脉注入,为确保肺内压不会突然升的过高常用缓慢滴注法,因此油酸注射时应用自动定时的注射器或间隔几秒的时间注射｡除了等渗盐水外,无水或高浓度乙醇和新鲜动脉血浆也可被用来作为油酸的溶液｡有学者用油酸诱导制造出了稳定的ALI幼猪模型,为肺损伤变化的早期研究提供了新的实验基础[21]｡
3.3 内毒素模型
该模型主要用于模拟临床中由于革兰阴性杆菌引起的肺损伤,如各种脓毒血症等｡也常用于临床上感染性休克所致肺损伤的研究[22]｡内毒素(lipopolysaccha-rides,LPS)感染居肺损伤危险因素的首位[23]｡LPS成分为脂多糖,体内注射脂多糖是最早用于诱导ALI动物模型的方法,LPS通常是从大肠杆菌中提取出来,其他LPS的来源如肠炎沙门菌也偶尔会被使用｡常用的治伤方法有气管滴入或物化､静脉注射和腹腔注射3种方法｡气管法则病变部位偏重于肺部,气管内灌注LPS0.5ml/kg(20μg/ml)能成功地建立ALI动物模型[24]｡静脉注射法过去常用在猪､犬和绵羊身上诱导ARDS｡对于犬来说,由于它们对LPS的耐受力强,因此极大剂量的LPS需要在这种动物模型中作常规使用｡目前,广泛采用LPS静脉注射的方式制作ALI或ARDS的小鼠或大鼠模型[25],何征宇等[26]采用小剂量LPS对小鼠进行连续腹腔注射的方法,成功制作了LPS诱导的小鼠ALI和肺纤维化的动物模型,从而弥补静脉注射的一些缺点｡最后值得注意的是LPS诱导的肺损伤动物模型和机械通气相关的肺损伤动物模型,在早期的生理学或生物学特性是不同的[27]｡
4 结语
本文以帮助研究者们选择最适合的动物模型为目标,讨论了目前常用的各种肺损伤动物模型的特点,分别阐述了各种模型的优缺点｡由于目前任何一种动物模型都不能充分复制出人类ALI/ARDS的全部特点,因此,选择ALI的动物模型需要考虑每种模型的特点,以及与人类之间的差异性之后再做出决定｡除此之外,随着基因研究技术的发展,运用转基因､基因敲除等技术手段选择研究出符合人类的动物模型也是大势所趋｡
ALI/ARDS动物模型的研究仍然是至关重要的｡因为到目前为止,尚无可替代动物模型作为工具来研究人类肺损伤病理生理过程的方法,所以不断探索符合人类肺损伤研究相应的动物模型制备仍然是非常重要的｡
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