【摘要】目的:建立牙周病与肺感染的实验动物模型,以排除临床各种干扰因素来探讨两者的关系｡方法:通过钢丝结扎+黏性高糖饮食法,建立不同程度的大鼠牙周病模型,各组均采用气管灌注(第2亚组)或口腔喂饲铜绿假单胞菌悬液(第3亚组)两种途径使大鼠肺脏感染,且设立不接触菌液的对照组(第1亚组)｡观察不同牙周病程度及不同感染途径叠加后对牙周炎和肺炎的影响｡结果:大鼠平均牙周袋深度及牙槽骨吸收总量:重度牙周病组(C组)>轻度牙周病组(B组)>牙周正常组(A组)｡中性粒细胞分类百分数:各组中第2亚组>第3亚组>第1亚组;且C2组>B2组与A2组,C3组>B3组与A3组｡25%的B3组大鼠及75%的C3组大鼠牙周袋内龈下菌斑中可检出铜绿假单胞菌｡结论:钢丝结扎+黏性高糖饮食法2周时可建立大鼠轻度牙周病模型,4周则可建立重度牙周病模型｡经口腔喂饲铜绿假单胞菌可导致大鼠肺感染,但严重程度不如气管灌注途径｡牙周炎症越重的大鼠深牙周袋内越易定植呼吸道致病菌,且合并的肺感染更为严重｡
【关键词】牙周病;肺感染;大鼠模型
    牙周病与肺感染的关系近年来逐渐受到人们的关注｡然而,国内外目前对它的研究大多限于临床实验,由于临床观察中常有很多干扰因素,如抗生素的使用､患者的意识状态､患者的全身状况及基础疾病的影响等,不能单纯反映出牙周病严重程度与肺感染两者之间的相互影响｡为了排除各种临床干扰,得出客观明确的科学结论,我们建立了牙周病与肺感染的实验动物模型,以求从一个新的角度探讨两者的关系｡
1 材料和方法
1.1实验材料
    Wistar大鼠36只,雌雄不拘,5周龄,体质量180-220g,于室温22-24℃,相对湿度40%-44%下饲养｡铜绿假单胞菌悬液(ATCC27853),密度109CFU/mL｡自制改良鼠牙周探针;直径0.2mm钢丝弯制的鼠龈下菌斑接种环｡
1.2实验方法
1.2.1实验分组
    将36只Wistar大鼠随机分为3组,每组12只｡
A组:牙周正常组｡正常饮食｡分3个亚组｡
A1组:4只,不采取任何措施,只进行各项指标的检测｡
A2组:4只,气管灌注109CFU/mL铜绿假单胞菌悬液0.2mL,96h(4d)后进行各项指标的检测｡
A3组:4只,口腔喂饲109CFU/mL铜绿假单胞菌悬液,0.1mL/48h,共喂2次,然后进行各项指标的检测｡
B组:轻度牙周病组｡用直径0.2mm的结扎丝结扎大鼠双侧上颌第一磨牙颈部,结扎线尽量放入龈沟内,若脱落则重新结扎,并喂饲10%黏性高糖饮食2周,建立轻度牙周病模型[1]｡分为3个亚组｡
B1组:4只,牙周病模型建立后即进行各项指标的检测｡
B2组:4只,完成牙周病模型建立后气管灌注菌悬液,方法同A2组｡
B3组:4只,完成牙周病模型建立后口腔喂饲菌悬液,方法同A3组｡
C组:重度牙周病组｡同样使用钢丝结扎+黏性高糖饮食的方法,持续4周,建立重度牙周病模型｡分为3个亚组｡
C1组:4只,牙周病模型建立后即进行各项指标的检测｡
C2组:4只,完成牙周病模型建立后气管灌注菌悬液,方法同A2组｡
C3组:4只,完成牙周病模型建立后口腔喂饲菌悬液,方法同A3组｡
1.2.2检测指标
① 鼠肺灌洗液的收集与分类计数:将灌流针头插入大鼠气管,缓慢注入3mL生理盐水,然后缓慢抽出灌洗液,共灌洗2次｡将灌洗液置入试管中,离心,沉淀物进行瑞氏染色,于油镜下做细胞分类计数[2],共计数200个细胞,观察巨噬细胞､淋巴细胞和中性粒细胞的百分比｡
②对肺灌洗液进行细菌培养:用无菌棉拭子蘸取肺灌洗液接种至血培养皿上,37℃培养48h后观察生长的菌落种类｡
③测量每只大鼠双侧上颌第一磨牙远颊､颊侧､近颊､远舌､舌侧､近舌6个位点的牙周袋深度,并计算平均值｡
④对每只大鼠双侧上颌第一磨牙龈下菌斑进行细菌培养:将特制接种环深入大鼠牙周袋内刮取龈下菌斑,并立即接种到血培养皿上,37℃培养48h后观察生长的菌落种类｡
⑤取大鼠的上颌骨,800mL/L乙醇固定,漂洗并去除软组织,测量每个上颌第一磨牙釉牙骨质界到牙槽嵴顶的距离,每牙测量远颊､颊侧､近颊､远舌､舌侧､近舌6个位点,各位点测量值之和为该牙的总牙槽骨吸收值｡
1.2.3模型的判定标准
    牙周病模型判定标准:依据大鼠双侧上颌第一磨牙牙周袋平均深度及牙槽骨吸收总量来判断牙周病模型的严重程度｡肺感染模型判定标准:依据大鼠肺灌洗液中性粒细胞分类百分比及是否能够从大鼠肺灌洗液中培养出接种的铜绿假单胞菌来判定肺感染模型的建立及严重程度｡
1.3统计方法
    实验结果数据用SPSS11.0统计软件包进行处理分析｡
2 结果
2.1各组大鼠的牙周袋深度及牙槽骨吸收总量
    统计各亚组4只大鼠的8个上颌第一磨牙牙周袋平均深度(表1)｡方差分析显示:A､B､C组三组内各亚组间差异均无显著性,而A､B､C组三组间则有显著性差异(P=0.000),其牙周袋深度C组>B组>A组｡经6个位点测量并相加后的牙槽骨吸收总量见表2｡方差分析显示各亚组间牙槽骨吸收总量差异均无显著性,而A､B､C组三组间则具有显著性差异(P=0.000),其牙槽骨吸收总量C组>B组>A组｡各组大鼠牙槽骨的吸收情况见图1｡
2.2各组大鼠肺灌洗液细胞分类计数结果

    各组大鼠肺灌洗液经离心沉淀后进行细胞分类计数的结果见表3,使用Kruskal-Wallis秩和检验对各组大鼠中性粒细胞百分数进行统计分析结果见表4｡表4中Kruskal-Wallis秩和检验显示:A､B､C3组中各亚组间中性粒细胞分类百分数差异有显著性(P<0.01),第2亚组(气管灌注菌悬液组)>第3亚组(口腔喂饲菌悬液组)>第1亚组(不接触菌悬液组)｡而在A､B､C3组的比较中,第1亚组(A1､B1､C1之间)中性粒细胞分类百分数差异无显著性(P>0.05),即3组大鼠在基线状态上差异无显著性,第2亚组(A2､B2､C2之间)和第3亚组(A3､B3､C3之间),其中性粒细胞分类百分数差异则具有显著性(P<0.05),C2组>B2组与A2组,C3组>B3组与A3组,即重度牙周病组中性粒细胞分类百分数较其余两组有显著性增加｡
2.3各组大鼠肺灌洗液及龈下菌斑致病菌培养结果(表5)
    在B3组有25%的大鼠龈下菌斑和肺灌洗液中均可检出铜绿假单胞菌,而C3组有75%的大鼠龈下菌斑和肺灌洗液中可检出一致的铜绿假单胞菌｡
3 讨论
3.1牙周病模型的建立
    本实验通过钢丝结扎+黏性高糖饮食法,利用菌斑在大鼠牙周局部大量积聚造成牙周破坏,建立牙周病模型｡大鼠口腔中微生物组成和人较相似,是易感牙周炎的近亲繁殖动物[3],因而是建立牙周病实验模型的常用动物｡使用牙周探针对各组大鼠牙周袋深度进行测量显示:A组牙周正常的大鼠牙龈菲薄而紧密地贴于牙面,牙周探针无法探入龈下;B组大鼠经过2周的钢丝结扎+黏性高糖饮食,其双侧上颌第一磨牙牙龈已出现水肿,牙周探针可轻易探入龈下,牙周袋深度为0.5-0.8mm,6个位点牙槽骨吸收总量达3.2-5.5mm,说明大鼠已存在轻度牙周炎;C组大鼠经过4周钢丝结扎+黏性高糖饮食,其双侧上颌第一磨牙牙周袋深度可达1.5-1.8mm,与B组相比差异具有显著统计学差异;6个位点牙槽骨吸收总量达9-11.5mm,说明大鼠牙周炎症已达较为严重的状态｡
3.2肺感染模型的建立

    本实验通过两种途径使大鼠感染铜绿假单胞菌:一种是从气管直接灌注菌悬液,另一种是通过口腔喂饲菌悬液｡经过预实验的反复筛选,选定109CFU/mL密度为能够导致大鼠感染但不会致死的适宜菌悬液密度｡铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)是一种G-杆菌,属非发酵菌,广泛分布于水､空气､土壤及正常人体皮肤､呼吸道及肠道黏膜,为条件致病菌[4]｡近年来,很多文献显示铜绿假单胞菌在重症卧床的老年肺感染患者中检出率呈逐年升高趋势｡齐晓红报道其在呼吸内科ICU病房医院感染微生物中占31.1%[5],同时它也越来越多地被用于建立肺感染的实验动物模型[6,7]｡气管直接灌注菌悬液是建立动物肺感染模型的经典方法,而本实验中利用口腔喂饲途径也可使大鼠肺灌洗液中中性粒细胞的百分比较正常组有显著升高,但至少需喂饲2次(需要反复接触感染)才能成功｡通过实验说明:大鼠口腔接触的铜绿假单胞菌可以经口咽部吸入,导致肺部感染炎症｡但吸入量较气管直接灌注少,因此产生的肺部炎症也相对较轻｡
3.3牙周病模型与肺感染模型的叠加效应
    表4显示:在未接触铜绿假单胞菌菌悬液的基线水平上,A组(牙周正常组)､B组(轻度牙周炎组)和C组(重度牙周炎组)大鼠肺感染严重程度无显著性差异｡在接受气管直接灌注铜绿假单胞菌菌悬液的第2亚组之间,C2组的肺灌洗液中性粒细胞的百分较B2组与A2组有显著升高,即在重度牙周炎大鼠中气管直接灌注产生的肺部炎症较轻度牙周炎组与牙周正常组严重,其原因可能与炎症介质及细胞因子的作用有关｡近年来很多研究显示:牙周病的炎症过程中,可产生大量与组织破坏相关的酶类(金属基质蛋白酶､纤维连接蛋白溶解酶等)及一些细胞因子(TNF-α､IL-6等)[8,9]｡Scanna-pieco[10]指出:这些酶类及细胞因子可改变呼吸道黏膜上皮的形态,从而促进病原菌的感染定植｡而另外一些文献则发现:TNF-α､IL-6等细胞因子在肺感染的炎症过程中也起了非常重要的作用[11]｡因此,在我们的实验动物模型中反映出重度牙周病组大鼠可合并为更严重的肺感染｡在接受口腔喂饲铜绿假单胞菌菌悬液的第3亚组之间,C3组的肺灌洗液中中性粒细胞的百分比也较B3组与A3组有显著升高(P=0.043),即在重度牙周炎大鼠中,通过口腔喂饲途径产生的肺部炎症也比轻度牙周炎组与牙周正常组严重｡在这个过程中同样存在前述的两个原因,即源于牙周组织的酶类和细胞因子破坏呼吸道上皮结构,及共同的细胞因子促进两者病变反应｡但由于此途径为经口腔感染,因此牙周组织还可充当细菌的贮库｡在重度牙周病大鼠的深牙周袋内(C3组),我们可从75%的大鼠龈下菌斑中培养出与肺灌洗液一致的铜绿假单胞菌,而在牙周袋较浅的B3组,也有25%的大鼠龈下菌斑中可培养出与肺灌洗液一致的铜绿假单胞菌｡在其余组的大鼠龈下菌斑中致病菌的培养则均为阴性｡这说明一些呼吸道致病菌较容易在炎症重且较深的牙周袋内定植,并进一步导致吸入性肺炎｡牙周袋是一个非常复杂的生物环境,其独特的解剖结构和理化特性可形成从有氧到无氧各种氧张力环境和许多特殊微环境,并具有适合微生物生长的温度(37℃)和湿度,很多细菌(如链球菌属､乳杆菌属等)可合成胞外多糖,这些长多糖纤维可包在细菌表面形成黏性的糖液,即黏附因子,而另一些G+菌的胞壁､胞膜和荚膜上还含有脂磷壁酸(LTA),它可与菌体表面的M蛋白结合构成纤毛状突起,因而也是一种黏附物质｡这些黏附因子和具有黏附作用的物质对于外来致病菌的定植起到非常重要的作用,加之牙周袋内适宜的温度､湿度､pH值､氧化还原电势和营养物质,使外来的呼吸道致病菌较容易定植下来[3],为进一步被吸入导致肺炎打下基础｡
    本实验排除了临床上多种因素的干扰,通过人为的方式使大鼠牙周袋接触呼吸道致病菌,建立吸入性肺炎模型,印证了临床上重症卧床老年患者吸入性肺炎的发病机制,也证实了重度牙周炎不仅可成为呼吸道致病菌的贮库,还可从免疫学水平加重肺部炎症｡为从临床上真正认识牙周病与肺感染的相互关系奠定了基础｡
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