【摘要】目的探讨大鼠脑出血微创后行神经干细胞移植对其神经功能恢复的影响｡方法(1)从新生24h内的Wistar乳鼠海马组织中分离出神经干细胞,利用无血清培养技术,在体外进行传代培养､标记和鉴定｡(2)采用未肝素化的心脏自体血制作大鼠尾状核脑出血模型｡将模型分为正常对照组､脑出血自然恢复组､脑出血微创组､脑出血移植组､脑出血微创+移植组｡(3)模型成功后24h行立体定向脑内血肿吸引清除术,出血后48h将体外扩增､纯化､并经BrdU标记的神经干细胞立体定向移植于血肿残腔内,不同时间点观察评估各组大鼠神经行为学改善情况｡(4)通过免疫组化及荧光双标检测移植人血肿残腔的神经干细胞在脑出血周边组织中的增殖､分化情况｡结果(1)大鼠脑出血后神经功能评分,脑出血自然恢复组在术后21d与3d比较明显减低(P<0.05),脑出血微创组､脑出血移植组及脑出血微创+移植组在术后14d､2ld与3d比较明显减低(P<0.05),脑出血微创组及脑出血移植组仅在术后21d时的评分明显低于脑出血自然恢复组(P<0.05),而脑出血微创+移植组在术后14d时的评分即较脑出血自然恢复组明显减低(P<0.05),其术后21d的评分也明显低于脑出血微创组和移植组(P<0.05),脑出血微创组与移植组各时间点的评分相比,差异无统计学意义(P>0.05)｡(2)大鼠脑出血周边组织中BrdU阳性细胞数在出血后7-14d明显增多,14d时达到高峰,21d时明显减少｡除3d外,在7d､14d和21d的3个时间点,脑出血微创+移植组BrdU阳性及NSE/BrdU双标阳性细胞数均多于脑出血移植组,差异具有统计学意义(P<0.05)｡结论从新生Wistar乳鼠海马组织中分离培养的是神经干细胞,并在体外能够长期培养和传代｡大鼠脑出血微创后行神经干细胞移植能明显促进其神经功能的恢复｡微创对神经干细胞在脑出血周边组织中的增殖､分化有促进作用。
【关键词】微创;脑出血;神经干细胞;移植
    脑出血是一种严重危害人类健康的中枢神经系统疾病｡患者即使幸存也留有不同程度的偏瘫､失语等症状,致使其生存质量严重下降,同时也给社会家庭带来沉重负担｡随着人们对神经系统可塑性､神经再生及干细胞认识的逐渐深入,神经干细胞移植已被应用于某些神经系统疾病的实验与临床治疗,其中部分成功线索使受损的中枢神经系统在结构和功能上的部分重建成为可能｡脑出血的内科治疗主要是以脱水降颅压､清除自由基等对症支持治疗为主｡近年来神经外科开展的微创手术因其在一定程度上降低颅压,减少血肿代谢产物对脑组织的损害等原因被广泛推广｡本课题拟研究在大鼠脑出血模型的基础上,应用立体定向血肿抽吸术,再行神经干细胞移植,在不同时间点观察神经干细胞的分布､迁移和分化｡为脑出血的治疗寻找新的治疗途径,为临床应用研究提供实验基础｡
1 材料与方法
1.1实验动物及分组
    实验动物选用体重180-2209的健康雄性Wistar大鼠102只,将Wistar大鼠随机分为正常对照组､脑出血自然恢复组､脑出血微创组､脑出血移植组､脑出血微创+移植组｡其中正常对照组6只,脑出血自然恢复组､脑出血微创组､脑出血移植组､脑出血微创+移植组各24只,分别设3d､7d､14d､21d 4个时间点检测指标｡每一时相点取6只大鼠检测指标,各组间动物体重无显著差异｡实验动物由佳木斯大学动物中心提供｡
1.2主要试剂
    表皮生长因子､碱性成纤维细胞生长因子､兔抗大鼠巢蛋白单抗(Nestin)兔抗大鼠特异性烯醇化酶(NSE)抗体､兔抗大鼠胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)抗体､兔抗大鼠BrdU一抗､山羊抗兔FITC抗体､山羊抗兔TRITC抗体､DAB显色试剂盒､SABC免疫组化染色试剂盒均购自北京博奥森生物有限公司｡
1.3方法
1.3.1神经干细胞的分离､培养､传代､标记及鉴定
    参照谭新杰等[1]的方法,采用特定培养液(含bFGF､EGF的DMEM)进行NSCs的原代培养及传代,2-3传代后行nestin免疫细胞化学染色鉴定;4-5代NSCs半量换液后,加BrdU溶液继续培养24—48h,离心后制成BrdU标记的NSCs单细胞悬液,调整细胞浓度,用于移植｡
1.3.2 免疫荧光及免疫组化染色
    根据使用说明书进行BrdU的单染､或NSE/BrdU双染操作｡
1.3.3 脑出血模型的制作及模型成功的判定
    采用未肝素化的心脏自体血建立脑出血模型,具体方法见参照文献㈦｡采用Longa法评分b1,无神经功能缺损为0分,出血后对侧肢体不能伸直为1分,出现转圈为2分,行走时身体向偏瘫侧倾倒为3分,意识消失,完全不能行走为4分,大于2分认为模型成功｡
1.3.4大鼠脑出血微创后神经干细胞的移植
    大鼠制作基底节脑出血模型后48h:微创十移植组大鼠经立体定向血肿残腔内缓慢注(>5min)用以移植的传代神经干细胞悬液10ul;微创组大鼠经立体定向血肿残腔内注入等量的生理盐水｡所有动物均不用免疫抑制剂｡
1.3.5脑组织的取材､切片及染色
    在造模后1､7､14､30d分别提取各组大鼠脑组织标本,多聚甲醛灌注固定法固定脑组织,梯度蔗糖脱水后冰冻冠状切片;各组切片行HE染色及BrdU､NSE/BrdU免疫组织化学染色;
1.3.6观察指标
(1)造模后3d､7d､14d､21d分别观察各组大鼠神经体征､行为,并按Longa EZ 5分制神经功能评分标准进行评分[3]｡(2)切片HE染色后镜下观察组织形态,免疫组化染色后镜下观察阳性表达及分布,脑组织切片免疫组化阳性细胞计数,在400倍显微镜下进行,采用网格计数法,每个时间点6只动物均以出血灶周边脑组织为观察部位｡每只动物每个指标取6张切片,每张切平选择5个视野,以细胞内出现棕黄色颗粒者为阳性｡数出每个视野的阳性细胞后计算平均阳性细胞数,再在同一组之间取平均值｡
1.4统计学处理
    各组数据以x±s表示,采用方差分析,应用SPSSl0.0软件分析数据,P<0.05差异具有统计学差异｡
2 结果
2.1 大鼠行为学观察及神经功能缺损评分
    所有大鼠在尾状核注射自体血4h后,神经功能评分均>2分｡与对照组比较各组神经功能缺损评分呈现下降趋势:脑出血自然恢复组在术后21d与3d比较明显减低(P<0.05),微创组､移植组及微创+移植组在术后14d､21d与同组3d比较明显减低(P<0.05),微创组及移植组仅在术后21d时的评分明显低于脑出血自然恢复组(P<0.05),而微创+移植组在术后14d时的评分较脑出血自然恢复组明显减低(P<0.05),其术后21d的评分也明显低于微创组和移植组(P<0.05),微创组与移植组各时间点的评分相比,差异无统计学意义(P>0.05)｡
2.2大鼠脑出血周边组织中BrdU阳性细胞的动态表达比较
    因脑出血自然恢复组与微创组未注入外源性的NSCs,故在脑出血周边组织中未有BrdU阳性细胞的表达｡脑出血行干细胞移植后3d,在脑出血周边组织中可见BrdU阳性的NSCs,细胞呈不规则排列,细胞被染为棕黄色,移植组与微创+移植组相比Br-du阳性细胞数差异无统计学意义(P>0.05);Td及14d时,移植组和微创+移植组BrdU阳性细胞数明显增多,差异具有统计学意义(P<0.05),21d时BrdU阳性细胞数明显减少,但微创+移植组仍多于移植组,差异具有统计学意义(P<0.05)。
2.3大鼠脑出血周边组织中NSE/BrdU双标阳性细胞的动态表达比较
    ICH后3d时,在脑出血周边组织中可见NSE/BrdU双标阳性细胞,移植组与微创+移植组相比NSE/BrdU双标阳性细胞数差异无统计学意义(P>0.05);ICH后7d,14d时,移植组和微创+移植组NSE/BrdU双标阳性细胞数明显增多,差异具有统计学意义(P<0.05)｡ICH后21d时NSE/BrdU双标阳性细胞数明显减少,但微创+移植组仍多于移植组,差异具有统计学意义(P<0.05)｡
3 讨论
    自发性脑出血是指原发的非外伤性的脑实质内出血｡发病率为每年60-80/10万,在我国约占全部脑卒中的20%-30%,发病后1m内病死率30%-50%,超过30%的存活者遗留严重的神经功能缺损｡其高发病率､高死亡率､高致残率,给个人､家庭以及社会､国家带来巨大的经济损失和沉重负担｡尽管脑出血的研究较多,但可选择的有效的治疗较少｡2006年前有10项随机对照研究,比较了开颅血肿清除术与内科保守治疗的临床效果,大部分的研究表明,手术治疗与内科治疗对患者的预后没有显著性差异｡但近年来随着研究的深入,微创血肿引流术有助于高血压脑出血患者神经功能的恢复､日常生活自理能力的提高及其预后的改善[4]｡神经干细胞的具有自我更新和多分化潜能｡且不会与受体组织发生免疫排斥｡已有研究证实神经干细胞移植可部分恢复神经功能,促进损伤组织修复和改善运动神经功能[5-7]｡
    本实验结果表明,在脑出血后21d,微创组的大鼠神经功能缺损评分优于正常对照组,显示微创穿刺血肿引流术能够减轻神经功能缺失程度,改善脑出血的预后｡在神经功能恢复方面,正常对照组术后21d的神经功能缺损评分较出血后3d显著降低(P<0.05),说明正常对照组也存在自我修复的能力｡但脑出血微创组､脑出血移植组､脑出血微创+移植组在出血后14d的评分即有明显降低(P<0.05),脑出血微创+移植组较脑出血微创组和脑出血移植组的改善更明显,其出血后21d的评分低于其它各组(P<0.05)｡这说明微创或单纯移植虽能促进受损组织修复,改善基底节脑出血大鼠的运动功能,但微创联合移植效果更为显著,其对神经功能的恢复具有明确的价值和意义｡在脑组织免疫组化染色方面,在出血后3d可见到少量的BrdU阳性及NSE/BrdU双标阳性细胞,出血后7-14d明显增多,14d时达到高峰,21d时明显减少｡除3d外,在7d､14d和21d的3个时间点,脑出血微创+移植组BrdU阳性及NSE/BrdU双标阳性细胞数均多于脑出血移植组,差异具有统计学意义(P<0.05)｡提示微创对NSCs在脑出血周边组织中的增殖､分化有促进作用｡微创后再行NSCs移植,能分化的神经元更多｡本文以脑出血大鼠模型为基础,研究发现大鼠脑出血微创后行神经干细胞移植,神经干细胞增殖情况良好,大鼠神经功能恢复明显｡但我们的研究仍很片面,移植时间和移植部位的选择以及通过改变神经干细胞局部生存的微环境来增加移植细胞在脑内的存活及分化,仍需要进一步的研究｡随着微创技术的发展和神经干细胞移植研究的不断深入,在脑出血的治疗上一定会出现一个里程碑式的飞跃｡
[参考文献]
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