摘要目的:研究广藿香油体外抗流感病毒､呼吸道合胞病毒､腺病毒､柯萨奇病毒及单纯疱疹病毒的效果,为抗病毒性感冒新药研发提供依据｡方法:建立流感病毒感染MDCK 细胞､呼吸道合胞病毒和腺病毒感染Hep-2 细胞､柯萨奇病毒感染Hela 细胞模型和单纯疱疹病毒感染Vero 细胞模型,以细胞病变效应( CPE) ､噻唑蓝( MTT) 法作为观察和检测指标,了解不同浓度药物体外抗病毒效果及药物对细胞的毒性,实验中分别以利巴韦林和阿昔洛韦作为对照药｡结果:广藿香油对MDCK､Hep-2､Vero 和Hela 细胞的TC50浓度均为0. 101mg /ml,TC0 浓度为0. 092mg /ml｡广藿香油能明显抑制柯萨奇病毒和腺病毒所致的细胞病变,IC50分别为0.081mg /ml､0. 084mg /ml,治疗指数( TI) 分别为1. 25､1. 20; 可抑制流感病毒,IC50为0. 088mg /ml,TI 为1. 15; 对呼吸道合胞病毒作用很低,IC50为0. 092mg /ml,TI 为1. 10; 对单纯疱疹病毒几乎没有抑制作用｡结论:体外抗病毒实验广藿香油显示出抗柯萨奇病毒､抗腺病毒､抗甲型流感病毒和抗呼吸道合胞病毒的作用,但不具有抗单纯疱疹病毒的作用｡
关键词 广藿香油; 抗病毒; 流感病毒; 呼吸道合胞病毒; 腺病毒; 柯萨奇病毒; 单纯疱疹病毒
广藿香药理研究主要集中在促进胃液分泌,增强消化道功能和胃肠平滑肌解痉作用,以及抗某些细菌[2]､真菌[3] 和病毒[4]方面｡广藿香油为其有效部位,有研究报道广藿香油具有明显的抗炎､抗菌､抗病毒､抗过敏､镇痛､镇咳､祛痰等作用[5 ~ 8]｡本研究基于广藿香及其提取物具有抗病毒作用,采用细胞培养法,体外观察药物对5 种呼吸道类病毒的抵抗作用,以期开发出抗呼吸道病毒的天然药物｡
1 材料与方法
1. 1 试验药物 广藿香原药材购于北京同仁堂,产地广州,经成都中医药大学中药鉴定教研室李敏教授鉴定为唇形科植物广藿香,符合药典标准｡广藿香油采用2010 年版中国药典附录挥发油提取法提取,获得棕黄色油状液体,避光密闭保存备用,试验时取本药物1ml ( 密度1. 012g /ml) 溶解于49ml 0. 5%Tween-80 中,成为白色液体制剂,药物浓度为20. 24mg /ml,022μm 微孔滤膜过滤除菌,于4℃保存备用｡临用时用相应细胞培养液稀释至所需浓度｡利巴韦林注射液( 规格100mg /ml) 天津药业焦作有限公司生产,批准文号: 国药准字H19992467,生产批号: 10110521｡阿昔洛韦注射液( 规格为0. 25g /瓶) 天津药、业焦作有限公司生产｡批准文号: 国药准字H20034034,生产批号: 10122403｡两种药物于试验时用无菌水做1 /10 稀释,使浓度为10mg /ml,于4℃保存备用｡临用时用相应细胞培养液稀释至所需浓度｡
1. 2 病毒株与细胞MDCK 细胞( 犬肾细胞) ､Hep-2 细胞( 人喉癌上皮细胞) ､Hela 细胞( 人宫颈癌细胞) ,Vero 细胞( 非洲绿猴肾细胞) 购自中国药品与生物制品检定所｡细胞复苏传代后使用,其中MDCK 和Hep-2 细胞的培养基为含10% 胎牛血清的DMEM 培养液; Hela 和Vero 细胞的培养基为含10% 胎牛血清的完全RPMI-1640 培养液｡
甲型流感病毒A / PR /8 /34( H1N1) 株购自国家流感中心; 呼吸道合胞病毒( RSV) 由四川大学华西医学中心提供; 柯萨奇病毒选用B 组3 型( CVB3) 源自四川省临检中心; 腺病毒选用常见3 型( Ad-3) 由甘肃省疾控中心馈赠; 单纯疱疹病毒选用1 型( HSV-1) 源自中国药品与生物制品检定所｡以上病毒株均于-80℃保存备用｡甲型流感病毒( H1N1) 使用前于9 日龄鸡胚尿囊腔连续传代2 次后,测血凝滴度为1: 512 后,用MDCK 细胞
培养; 呼吸道合胞病毒( RSV) 与腺病毒( Ad-3) 用Hep-2 细胞培养; 柯萨奇病毒( CVB3) 用Hela 细胞培养; 单纯疱疹病毒( HSV-1) 用Vero 细胞培养｡
1. 3 试剂 Dulbecco＇s Modified Eagle Medium( DMEM) ( 批号1345538) ,RPMI Medium 1640 ( 批号1313945) 均购自GibcoTM公司｡胎牛血清( FBS) ( 批号NVM0347) 购自HyClone 生物化学制品( 北京) 有限公司｡青霉素G 钠､链霉素购自美国Corning公司｡0. 25% EDTA-胰酶购自Amresco 公司｡4,5-二甲基噻唑-2,5-二苯基四唑溴化物( MTT) ,Tween-80 购自SIGMA 公司｡
1. 4 仪器OLYMPUS 倒置显微镜,日本奥林巴斯公司,型号: CKX41｡酶标仪,美国Thermo Scientific 公司,型号: Varioskan Flash｡
1. 5 方法
1. 5. 1 药物的细胞毒性测定 根据Mosmann 建立的MTT 法检测药物对MDCK､Hela､Hep-2､Vero 细胞的毒性[9]｡用0. 25%EDTA-胰酶将生长成单层的MDCK､Hela､Hep-2 和Vero 细胞消化后制成细胞悬液,调整细胞浓度为1 × 105 个/ml,按100μl /孔
接种于96 孔细胞培养板,置37℃,5 % CO2培养箱中培养24h｡待细胞长成完整单层后,弃上清液,PBS 洗细胞3 次｡加入不同浓度的含药细胞培养液200μl /孔,药物从20. 24mg /ml 开始,先10 倍次稀释,确定大致毒性范围后在该范围内做连续稀释,每个药物的稀释浓度平行做3 复孔,同时设置连续对倍稀释的0.5%Tween-80 和正常细胞对照组,置37℃,5% CO2培养箱中连续培养, 72h 后,采用MTT( 终浓度0. 5g /l) 比色法在492nm 测定OD 值,按下式计算抑制率,再按Reed-Muench 法[10]计算药物的半数中毒浓度( TC50) 和最大无毒浓度( TC0) [11]｡
细胞存活率( %) = ( 药物组平均OD 值/正常细胞对照组平均OD值) × 100%
细胞抑制率( %) = 100% - 细胞存活率
1. 5. 2 病毒感染性测定将各病毒株用3%胎牛血清DMEM进行连续10 倍次稀释｡流感病毒接种MDCK 细胞､呼吸道合胞病毒和腺病毒接种Hep-2 细胞､柯萨奇病毒接种HeLa 细胞､单纯疱疹病毒接种Vero 细胞｡待相应96 孔板细胞长成完整单层后,弃上清液,PBS 洗细胞3 次｡按100μl /孔加入10-1 ~ 10-15不同稀释度病毒,每个稀释度平行做3 个复孔,同时设置正常细胞对照｡置37℃,5%CO2培养箱中连续培养7d 后观察感染细胞圆缩､脱落等细胞病变( cytopathic effect,CPE) 情况｡CPE 记录方法为: ( -) 细胞正常生长,无病变出现; ( ± ) 细胞病变少于整个细胞单层的10%; ( + ) 细胞病变少于整个细胞单层的25% ; ( + + ) 为25% ~ 50% 细胞出现病变; ( + + + ) 为50% ~ 75%细胞出现病变; ( + + + + ) 为76% ~ 100% 细胞出现病变｡以测定各病毒引起50% 组织细胞病变的感染剂量( 50% tissue culture infective dose,TCID50) ｡
1. 5. 3 药物抗病毒试验按100μl /孔,在96 孔培养板的MDCK单层细胞中加入终浓度为100 × TCID50流感病毒液,Hela 单层细胞中加入终浓度为100 × TCID50柯萨奇病毒液,Hep-2 单层细胞中分别加入终浓度为100 × TCID50呼吸道合胞病毒液和腺病毒液,Vero 单层细胞中加入终浓度为100 × TCID50单纯疱疹病毒液,置37℃,5 % CO2
培养箱中吸附2h｡吸弃病毒液,用无血清培养基( DMEM 或RPMI-1640) 洗涤两次,然后分别加入已稀释好的不同浓度药物与利巴韦林或阿昔洛韦工作液,不同稀释度各药物均重复3 孔｡实验中设置病毒对照和正常细胞对照｡各培养板置37℃,5 % CO2连续培养,每天观察CPE 一次｡此实验重复3 次｡当病毒对照组细胞CPE 达+ + + ~ + ++ + 时,采用MTT 法测定OD 值,按下式计算病毒抑制率,另按Reed-Muench 法计算药物的50% 细胞病变抑制浓度( 50% inhibitingconcentration, IC50) ,并按照治疗指数( TI) 公式: TI =TC50 / IC50,计算药物的治疗指数｡病毒抑制率( %) = ( 药物组的平均OD 值- 病毒对照组的平均OD 值) /( 对照组的平均OD 值- 病毒对照组的平均OD值) × 100%
2 结果
2. 1 药物的细胞毒性
在受试期间内,正常对照孔细胞形态正常｡药物对4 种细胞的毒性结果一致,表现为细胞皱缩､粘66 中药药理与临床 2012; 28( 6)连､脱落,MTT 法检测其光密度值明显下降｡细胞TC50和TC0结果见表1｡
表1 药物对细胞的TC50
2. 2 各病毒TCID50的测定
流感病毒( H1N1) 接种MDCK 细胞后约3d 出现CPE,单纯疱疹病毒1 型( HSV-1) 接种Vero 细胞､柯萨奇病毒B3 ( CVB3) 接种Hela 细胞､呼吸道合胞病毒( RSV) 和腺病毒3 型( Ad-3) 接种Hep-2 细胞后约5d 出现CPE｡依据CPE 实验结果,按Reed-Muench 法计算H1N1 的TCID50为1 × 10-4 ,HSV-1 的TCID50
效价为1 × 10-9 ,RSV 的TCID50效价为1× 10-11 ,CVB3 和Ad-3 的TCID50效价均为1 × 10-12｡
2. 3 药物抗病毒结果
2. 3. 1 药物抗流感病毒结果
在试验时间内正常对照孔细胞形态正常,流感病毒感染对照孔细胞在预计时间内出现明显的CPE｡从CPE 观察和MTT 检测结果( 表2) 可看出药物对流感病毒的有效最大抑制浓度为92μg /ml,抑制率为66. 67%,IC50为0. 088mg /ml,治疗指数TI 为1. 15｡
表2 药物体外抗流感病毒感染试验结果(x± s,n = 3)
2. 3. 2 药物抗单纯疱疹病毒结果
在试验时间内正常对照孔细胞形态正常,单纯疱疹病毒感染对照孔细胞在预计时间内出现明显的CPE｡从CPE 观察和MTT 检测结果( 表3) 可看出药物对单纯疱疹病毒1 型的感染几乎没有作用,有效最大抑制浓度为92μg /ml 下的抑制率为19. 44%｡
表3 药物体外抗单纯疱疹病毒感染试验结果(x± s,n = 3)
2. 3. 3 药物抗柯萨奇病毒结果
在试验时间内正常对照孔细胞形态正常,柯萨奇病毒3 型感染对照孔细胞在预计时间内出现明显的CPE｡从CPE 观察和MTT 检测结果( 表4) 可看出药物对柯萨奇病毒3 型的有效最大抑制浓度为92μg /ml,抑制率为86. 11%, IC50
为0. 080mg /ml,治疗指数TI 为1. 25｡
表4 药物体外抗柯萨奇病毒感染试验结果(x± s,n = 3)
2. 3. 4 药物抗呼吸道合胞病毒结果
在试验时间内正常对照孔细胞形态正常,呼吸道合胞病毒感染对照孔细胞在预计时间内出现明显的CPE｡从CPE 观察和MTT 检测结果( 表5) 可看出药物对呼吸道合胞病毒感染抑制作用较弱,最大抑制浓度为92μg /ml,抑制率30. 56%, IC50为0. 092mg /ml,治疗指数TI为1. 10｡
表5 药物体外抗呼吸道合胞病毒感染试验结果(x± s,n = 3)
2. 3. 5 药物抗腺病毒结果
在试验时间内正常对照孔细胞形态正常,腺病毒3 型感染对照孔细胞在预计时间内出现明显的CPE｡从CPE 观察和MTT 检测结果( 表6) 可看出药物对腺病毒3 型的有效最大抑制浓度为92μg /ml,抑制率为80. 56%,IC50为0. 084mg /ml,治疗指数TI 为1. 20｡
表6 药物体外抗腺病毒感染试验结果(x± s,n = 3)
3 讨论
呼吸道病毒是一大类能侵犯呼吸道引起呼吸道局部病变或仅以呼吸道为侵入门户,主要引起呼吸道组织器官病变的病毒,是引起急性呼吸道传染的主要病原体｡据统计, 90%以上急性呼吸道感染由病毒引起,尤以上呼吸道感染为临床上的常见中药药理与临床 2012; 28( 6) 67病和多发病｡目前,已知能引起急性呼吸道感染的病毒有l0 多种,其中流感病毒[12]､腺病毒､呼吸道合胞病毒和单纯疱疹病毒[13]以及属于肠道病毒的柯萨奇病毒[14]是引起感冒等急性上呼吸道感染的主要病毒｡这些病毒一般通过空气飞沫传播,感染途径容易实现,其次因缺乏有效和持久的免疫,经常引起很高的发病率和超额死亡率｡特别是在流感高发季节和暴发流行期,常引起小儿及老年人的并发症和严重病例｡虽然现在可以使用疫苗预防,但只对流行性感冒病毒有效,对其他呼吸道病毒的效果不理想,而且免疫效期也比较有限｡在治疗方面,迄今为止,没有发现任何一种西药既有很好的效果又无毒性｡我国应用祖国医学中草药治疗流感有数千年历史,临床有效的方药不少,用来治疗各种感染性疾病的探索已成为国际医学界研究的方向｡50-70 年代,国内曾用体外方法对大量的中草药进行筛选,但都未发现理想的抗病毒中药｡
本实验以广藿香的提取物广藿香油作为研究对象,研究其对流感病毒､腺病毒､呼吸道合胞病毒､单纯疱疹病毒和柯萨奇病毒的抗病毒作用｡结果发现挥发油对5 种病毒的最有效浓度均是92μg /ml,在该浓度下对H1N1 的抑制率为66. 67%,对CVB3 的抑制率为86. 11%,对Ad-3 的抑制率为80. 56%,对RSV 抑制率为30. 56%,对HSV-1 的抑制率为19. 44%｡阳性药物利巴韦林或阿昔洛韦对相应病毒均有75% 以上的抑制率｡以阳性药物利巴韦林和阿昔洛韦对病毒的抑制率作为标准来看,广藿香油对CVB3 和Ad-3 的抑制作用很高,对H1N1 的抑制作用较弱,对RSV 的抑制作用很低,对HSV-1 几乎无抑制作用｡这个结果对于后续以柯萨奇病毒作为研究目标,建立由柯萨奇病毒引起的小鼠病毒性心肌炎动物模型,研究药物对该病症模型的抗病毒作用奠定实验基础｡由于研究的5 种病毒基因组中,H1N1 和RSV 属于有包膜的RNA 病毒,HSV-1 为有包膜的DNA 病毒,CVB3 为无包膜的小RNA 病毒,Ad-3 为无包膜的DNA 病毒,由此推测广藿香油对无包膜的病毒有一定的抑制作用,抑制机制可能是药物直接作用病毒衣壳,阻断病毒吸附细胞,不过具体作用机制有待后续对药物抗病毒分子机制的进一步研究｡
参考文献
1 徐国钧,王强. 中草药彩色图谱. 福州: 福建科学技术出版社,2006∶406
2 吴周和,刘建成,吴小刚. 藿香中天然防腐剂的提取方法及其抑菌作用研究. 中国调味品,2004; ( 8) ∶ 18 ~ 20
3 莫小路,严振,王玉生,等. 广藿香精油对植物病原真菌的抑菌活性研究. 中药材,2004; 27( 11) ∶ 805 ~ 807
4 刘亮锋,黄晓丹,蔡大可,等. 广藿香油及藿香油的研究概况. 中国中医药信息杂志,2009; 16( 2) ∶ 100 ~ 102
5 刘尧,毛羽. 广蕾香挥发油止咳化痰药理实验的研究. 时针国医国药, 2007; 18( 8) ∶ 1920 ~ 1921
6 陈小夏,何冰,李显奇,等. 广蕾香三种提取物对肠道功能作用的比较. 中药药理与临床,1998; 14( 2) ∶ 31 ~ 33
7 陈小夏,何冰,李显奇,等. 广蕾香胃肠道药理作用. 中药材, 1998; 21( 9) ∶ 465 ~ 467
8 杜一民,陈汝筑,胡本荣. 广蕾香的化学成分及其药理作用研究进展. 中药新药与临床药理, 1998; 9( 4) ∶ 238 ~ 241
9 Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:application to proliferation and cytotoxicity assays. Immunol Methods,1983;65∶ 55 ~ 63
10 中国医学科学院流行病防治研究所编. 常见病毒实验技术. 北京:科学出版社, 1978∶ 34
11 中华人民共和国卫生部药政局. 抗病毒药物药效指导原则. 新药( 西药) 临床前研究指导原则汇编, 1993∶ 164
12 彭绍忠,李耿,秦臻,等. 广藿香不同提取部位体内抗流感病毒作用研究. 时珍国医国药,2011; 22( 11) ∶ 2578 ~ 2579
13 雷湘,陈科力,黎莉,等. 卷柏属药用植物提取物体外抗柯萨奇病毒作用研究. 中药药理与临床, 2007; 23( 5) ∶ 110 ~ 113
14 赵勤,冯宝平,胡锐,等. 朱砂七抗Ⅱ型单纯疱疹病毒的体外研究.中药药理与临床,2012; 28( 3) ∶ 79 ~ 80
